手動(dòng)生化

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手動(dòng)生化

　　一、生化實(shí)驗(yàn)步驟

　　手動(dòng)生化按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，不同指標(biāo)實(shí)驗(yàn)操作不一樣，主要為抗氧化指標(biāo)，包括SOD，MDA，GSH-PX，GSH，NO，NOS，CAT。

　　1.樣本前處理

　　血清血漿：如有渾濁需3500轉(zhuǎn)/分左右，離心10分鐘，取上清待用。將澄清的血清血

　　漿用生理鹽水稀釋成不同濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

　　組織：準(zhǔn)確稱(chēng)取組織重量，按照重量(mg):體積(ul)=1:9的比例加入9倍體積生理

　　水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，2500-3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清即10%勻漿上清液待用。組織樣本需測(cè)蛋白濃度。

　　2.BCA蛋白濃度測(cè)定

　　標(biāo)準(zhǔn)品配制：取1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到25mgBSA的蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，即為25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長(zhǎng)期保存。取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為0.5mg/ml。標(biāo)準(zhǔn)品最好與蛋白樣品用同樣的溶液稀釋?zhuān)ǔＪ褂?.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

　　加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板中，不足20ul的加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20ul。將待測(cè)的蛋白樣品稀釋至合適濃度，加入到96孔板中，使待測(cè)樣品總體積也為20ul。

　　BCA工作液配制：根據(jù)樣本數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積硫酸銅溶液(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

　　反應(yīng)及檢測(cè)：每孔加入BCA工作液200ul，充分混勻(可將酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30s)，60℃放置30min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比，在562nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄各孔吸光度值。

　　計(jì)算：以標(biāo)吸光值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可反算出相應(yīng)的蛋白濃度，乘以樣本稀釋倍數(shù)即為樣本實(shí)際濃度。

　　3. 根據(jù)不同指標(biāo)的說(shuō)明書(shū)，按照操作表設(shè)置對(duì)照管測(cè)定管及空白管，加入相應(yīng)的試劑及樣本，反應(yīng)后在指定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)計(jì)算公式算得樣本指標(biāo)含量。

　　二、注意事項(xiàng)

　　1、樣本要求：樣本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除;避免使用溶血樣本。樣本收集后若不立即檢測(cè)，凍存于-80°冰箱，避免反復(fù)凍融。樣本每次檢測(cè)使用前要混勻，用完后將相應(yīng)版布局及樣本編號(hào)記錄在實(shí)驗(yàn)本上，樣本及時(shí)放入冰箱。

　　2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　核對(duì)樣本個(gè)數(shù)、編號(hào)、樣本量是否足夠，是否有溶血的情況，核對(duì)試劑盒保質(zhì)期。注意訂單上備注欄客戶(hù)的要求，是否做復(fù)孔等。如有問(wèn)題及時(shí)與銷(xiāo)售溝通。

　　3、操作要求

　　1.試劑配制要精確，點(diǎn)樣量一定要精確，完全打盡移液槍內(nèi)樣本與試劑;

　　2.孵育溫度與時(shí)間準(zhǔn)確;嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)上步驟操作。

　　3.用多道移液器來(lái)加共同試劑或底物應(yīng)用液以縮短時(shí)間，減少各孔間的誤差。

　　4.加樣后充分混勻，保證樣本與試劑的充分接觸。

　　5.有些指標(biāo)的試劑需要-20℃保存，有的試劑在低溫條件下會(huì)出現(xiàn)渾濁或結(jié)晶，需要37℃溶解。注意試劑盒上的標(biāo)注。

　　6.NOS促進(jìn)劑最好現(xiàn)配現(xiàn)用，配好后盡量一日內(nèi)用完，如有剩余則-20℃以下保存不超過(guò)一周;未配置前如淡黃色或白色粉末變成咖啡色或黃褐色顆粒則失效不可用。

　　7.GSH-PX標(biāo)準(zhǔn)品注意要現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　8.SOD酶夏天不穩(wěn)定，冬天還好一點(diǎn)，盡量控制實(shí)驗(yàn)時(shí)間在同一時(shí)間段進(jìn)行。

　　9.CAT實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生氣泡和沉淀，如產(chǎn)生沉淀，吸取上清后再檢測(cè)，避免吸到氣泡。

　　10.由于微孔板在水浴鍋中反應(yīng)，板底會(huì)有水，所以每次檢測(cè)之前都要將板底擦干再放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)。水浴煮沸時(shí)小心燙傷。

　　注：以上均為實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)指標(biāo)的注意事項(xiàng)，如有客戶(hù)自己訂購(gòu)的試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

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